产品简介
EZ-Assembly One-Step Multi-fragment Cloning Kit是一款高效的一步法多片段无缝克隆试剂盒，可通过单个反应将一个或多个DNA片段同时插入到任何载体的任何位点，不产生多余的碱基序列。本试剂盒操作简单，只需制备线性化载体和扩增含有载体末端同源序列（15 ~ 20 bp）的插入片段，将两者按照一定比例混合，加入2× Multi-fragment Fusion Mix，50°C反应5 ~ 30 min即可进行转化，完成定向克隆。2× Multi-fragment Fusion Mix含同源重组酶及高度优化的缓冲液体系，具有很高的多片段重组效率，可兼容1 ~ 5个片段的同源重组，同时保证了克隆成功率。
产品组分
组分 |
EZ1102-01(5 Rxns) | EZ1102-02(20 Rxns) | EZ1102-03(40 Rxns) |
2× Multi-fragment Fusion Mix*1 | 55 μl | 220 μl | 440 μl |
注:*1. 包含同源重组酶及高度优化的缓冲液体系。
保存条件
本产品建议置于-20°C保存。过期日期详见产品标签中有效期信息。
自备材料
片段扩增所需模板及引物、线性化载体、高保真酶、感受态细胞（如DH5α Competent cell）、ddH2O、PCR管、PCR仪等。
实验流程
1.目标载体的线性化：通过酶切或反向PCR获得线性化载体。
2.插入片段的扩增：由PCR制备，所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源序列（图中以黄色、红色、绿色和蓝色标记），使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有15 ~ 20 bp的同源序列。
3. 同源重组反应：将线性化载体和各插入片段按比例混合，50°C反应5 ~ 30 min即可完成重组反应，实现多个线性化DNA的体外环化。
4. 同源重组产物转化：同源重组产物直接进行转化，平板上会形成单克隆供后期阳性克隆检测。
代表性实验结果
1.使用EZ-Assembly One-Step Cloning Kit分别进行插入一个片段和插入三个片段的同源重组反应及后续的大肠杆菌转化，得到结果如下图。可以看出，本试剂盒可以高效兼容一至三个片段同源重组，具有很高的重组效率以及克隆成功率。
A. 插入一个片段的重组产物转化平板。载体pGADT7（8.0 kb）通过ECORⅠ和BamHⅠ双酶切线性化，插入一个800 bp的片段，线性化载体与插入片段的摩尔比为1:2，50°C反应5 min。
B. 同时插入三个片段的重组产物转化平板。使用与单片段插入一样的线性化载体，三个插入片段长度分别为650、750、800 bp，总计2200 bp，线性化载体与每个插入片段的摩尔比为1:1，50°C反应15 min。
C. 插入一个片段的菌落PCR鉴定结果，挑取A图10个单克隆，PCR产物大小均为800 bp，阳性率100%。
D. 插入三个片段的菌落PCR鉴定结果，挑取B图2个单克隆，单个片段的PCR产物大小分别为650、750、800 bp，最终连接片段的大小为2200 bp。
相关详细信息，请查看产品说明书。
